在生物技术中，质粒通常被用作重组DNA复制和克隆的载体。几十年来，科学家们一直在使用质粒来发展治疗方法，其中最近的一种是著名的CAR-T疗法。但是，尽管许多基于质粒的疗法很有前景，它们也存在一些问题。
”质粒包含特定的区域，称为复制起源、抗生素耐药元素和标记基因，这些区域是稳定维持和放大细菌中质粒进行大规模生产所需的。”的首席执行官马丁·施莱夫博士说PlasmidFactory．“这些元素有不同的缺点，比如毒性。它们包含被称为CpG基序的序列，已知可在真核细胞中诱导免疫反应。因此，如果质粒被用于任何治疗应用，它们可能会在人体中造成不良影响。”
质粒的另一个缺点是，在细胞做出防御性反应或死亡之前，可以插入细胞的DNA剂量有限。“你可以使用的剂量总是取决于一种物质的毒性，”Schleef补充道。“就质粒而言，从某一时刻起，DNA可能会过多。”
避开了小圆DNA质粒的陷阱
为了从质粒的优点中获益并规避它们的缺点，Schleef和他的团队在PlasmidFactory已经开发了一种生产所谓小圆DNA的专有技术。
就像质粒一样minicircle DNA是圆形，双股，超螺旋。然而，与质粒不同的是，它不包含有毒或破坏性的DNA序列。“我们已经找到了一种方法，通过减少质粒来去除这些元素，使其只包含有小伤疤的感兴趣基因，这是在制造过程中无法避免的残留元素。”Schleef解释道。
小圆DNA有很多优点。由于它们体积小，很容易被转染到靶细胞的细胞核中;由于没有残留的细菌主干，因此消除了不良免疫反应和细胞毒性的危险;小圆DNA在细胞中停留的时间更长，从而提高药物的性能。
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“通过减少质粒中DNA的数量，治疗中的活性分子可以更高，”Schleef补充道。“因此，该产品的物质含量允许更多分子的应用，仍然保持在毒性水平以下，并使感兴趣的基因在目标细胞中表达。”
小圆DNA是如何形成的
形成一个小圆的过程从放置感兴趣基因的亲代质粒开始。“当客户给我们发送一个基因时，我们将其从原始质粒中取出，植入我们的亲代质粒中，并在细菌细胞中培养。”项目经理Marco Schmeer博士解释道PlasmidFactory．“生长后，我们进行化学诱导，激活重组酶。重组酶在质粒中形成顺式重组——顺式是指同一分子内的顺式重组，使其看起来类似于8。”
最终，这八个原子分开，形成两个独立的、超卷的、更小的圆圈。一个圆圈包含了所有不需要的质粒DNA，包括选择标记、复制起点和所有不必要的细菌序列。另一个圆是小圆，只包含感兴趣的基因和靶细胞中调控所需的元素。
“这种产品，小质粒和小圆，仍然在细菌细胞中，”Schmeer指出。“为了纯化，我们有一个特别设计的亲和层析，它可以选择性地区分分子。当我们洗掉所有不需要的分子时，它会固定住小圆。小圆环随后从色谱柱中被稀释，不含任何其他细胞污染物，如内毒素或不需要的DNA。”
由此产生的minicircle是螺旋状和超螺旋状的，对基因表达有积极影响。从制药的角度来看，这种微圆的另一个优点是它是单体的，这意味着研究人员可以依靠同质产品。
的睡美人CAR-T治疗系统
的使用minicirclesCAR-T疗法的发展是一种新的有前途的方法。目前，唯一批准的技术，允许基因修饰的T细胞发展个性化的CAR-T治疗使用慢病毒载体。然而，众所周知，慢病毒载体会整合到目标细胞的部分基因组中，这可能导致突变和遗传毒性，引发对其安全性的担忧。此外，高昂的成本和严格的监管指南阻碍了临床的快速周转。
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另一种将遗传物质整合到细胞基因组中的方法叫做睡美人转座子系统。在这个过程中，基因被随机整合到基因组中，由于大约96%的基因组是非编码的，发生不必要突变或遗传毒性的风险要低得多，同时提高了安全性。
“作为慢病毒载体的替代品，研究人员尝试了睡美人转座子系统与普通质粒，”Schleef解释道。“他们很快意识到，特别是对T细胞来说，质粒的DNA是有毒的，很大一部分T细胞在吸收这种DNA后死亡。”
另一方面，用小圆圈睡美人转座子系统运行良好，因为与质粒不同，微圆不含有害的DNA。这是研究结果由PlasmidFactory的主要合作者德国Würzburg大学进行。
对于CAR-T治疗发展而言，小圆DNA的另一个优势是其生产速度要比慢病毒载体快得多，因此成本效益更高。慢病毒载体需要产生三到四种不同的质粒，而小圆形DNA可以直接转染到T细胞中。
“在这种情况下，我们只需要两个分子来转染T细胞，”Schleef说。“一个是含有CAR基因的小圆圈，另一个是将其放入T细胞基因组的酶。对于正在计算这种治疗费用的人来说，这是一个重要方面。”
对未来的宏伟计划
“在过去的几年里，我们一直致力于扩大迷你圆的生产规模。”Schleef解释道。“在微圆开发之初，我们在20到100微克的尺度上工作，这不是很多。现在，我们收到来自世界各地的更大数量的请求，所以我们已经开始使用毫克，并期待着增加这一数量。总的来说，我们的技术很容易扩展。”
与CAR-T治疗领域的专家一起，该团队在PlasmidFactory还致力于生产更高质量等级的小圆DNA，以满足大多数监管机构的要求。
“我们创建了一个专门的实验室设施，一次只生产一种小圆DNA，以防止任何潜在的污染，净化过程也完全独立。”Schleef说。“特殊的净化程序使我们能够生产超卷曲的小圆单体，满足同质、活性和高质量产品的要求。有了小圆DNA，我们将能够改变CAR-T疗法。”
您是否在CAR-T治疗领域工作，并想了解更多关于小圆DNA的知识?取得联系和PlasmidFactory的专家们一起分享!
图片来自Shutterstock & PlasmidFactory
作者:Larissa Warneck, Labiotech.eu科学记者
